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For immunofluorescence, we used anti-Arhgef7 (Millipore, #07-1450, 1:200), rabbit anti-NF medium chain (Abcam #ab64300, 1:200), mouse Tau-1 (Chemicon #MAB3420; 1:500), mouse anti-MAP2 (Chemicon #AB5622; 1:1000), Tuj 1 (R&D Systems #MAB1195, 1:1000), and goat secondary antibodies labeled with Alexa 488 or 594 (Molecular Probes). Nuclei were stained with Hoechst 33342 (Molecular probes #C2110, 1:6000). CellTracker Blue CMAC (Molecular Probes, 1:1000 of 10 mM solution) was used as a cell volume marker. The Arhgef7 expression vectors were generated from mKIAA0142 (corresponding to NM_001113517.1) by amplifying the coding sequence by PCR and cloning it into the pEGFP-C1 (Clontech) or pcDNA3.1-HA (Invitrogen) vectors. Confira todas as regras da oferta no wigan afc site. The vectors for Cdc42 F28L and pGST-PBD have been described previously 7,8,54 . The coding sequence for mouse TC10 was amplified by PCR and cloned into pGEX4-T2 and pEGFP-N1. The fast cycling mutant TC10 F34L 7,56 was generated by site directed mutagenesis using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) with the primers 5′-AACGACGCCT TACCCGAGG AGTACG-3′ and 5′-TCCTCGGGTA AGGCGTCGTT GGC-3′. To generate an shRNA vector directed against Arhgef7 (Arhgef7 RNAi) an shRNA with the target sequence 5′-AGGGAGTGAG GGAGAGAACG-3′ was cloned into the Xho I and Eco RI sites of the pCAGGS-U6 vector 71 . An RNAi-resistant Arhgef7 vector was created by introducing 2 synonymous mutations into the binding site for the shRNA in Arhgef7 (Arhgef7-res) by site directed mutagenesis using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) according to the manufacturer’s instructions with the primers 5′-GGTTTCATCT ATCAGGGAAA GCTGCCGACA ACGGGAATG-3′ and 5′-TGTGATTGTC ATTCCCGTTG TCGGCAGCTT TCCCTGATA-3′. Dissociated cortical and hippocampal neurons from embryonic day 18 (E18) rat or E17 mouse embryos were prepared and transfected by calcium phosphate co-precipitation as described previously 5,71 . Neurons were plated at 70,000 cells per well in a 24-well plate coated with poly-L ornithine in Neurobasal medium (Life Technologies) and cultured at 37 °C and 5% CO 2 . The culture medium was replaced by 400 μl Opti-MEM (Life Technologies) before the DNA/ CaCl 2 mixture was added. After incubation for 45 min at 37 °C and 5% CO 2 the neurons were washed for 15 min with 1 ml opti-MEM, which had been pre-incubated at 37 °C and 10% CO 2 , and Neurobasal medium was added back to the cells.

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